如题所示，在日常制备LNP或者其他纳米粒子的过程中，通常液滴会滴落在15ml离心管底，滴落的高度通常超过120mm，这种冲击是否对样品质量有影响了？也许可以参考辉瑞在《Nature》发表的这篇文章，对比实际情况。
标题
搅拌与震荡对 mRNA-LNP 药物产品质量特性的影响
作者
Roman Matthessen¹,²、Robbe Van Pottelberge¹,²*、Ben Goffin¹、Giel De Winter¹
¹ 辉瑞比利时普尔斯 - 圣阿曼兹工厂，欧盟制造科学与技术卓越药物产品中心，中试放大车间；
² 两位作者对本文贡献均等；* 通讯邮箱：robbe.vanpottelberge@pfizer.com
摘要
新冠疫情爆发后，基于 RNA - 脂质纳米粒（LNP）的药物研发热度大幅提升。2018 年首款 RNA-LNP 药物 Onpattro 获批上市，而 mRNA-LNP 疫苗（辉瑞 Comirnaty、莫德纳 Spikevax）在 2020 年末获批，才真正开启大规模工业化生产。目前行业对 RNA-LNP 产品的认知仍在持续完善。
本文系统研究
大规模搅拌与
实验室瓶内震荡两种机械应力对 mRNA-LNP 药物质量指标的影响。结果证实：搅拌、震荡会显著改变 LNP 粒径分布，同时降低 mRNA 包封率，二者存在直接关联；文章提出完整作用机理。针对不同灌装规格的制剂研究显示：顶空体积、LNP 浓度会直接影响产品对震荡应力的敏感程度。本研究结论对大 / 小规模生产企业、临床医护人员及患者均具备重要指导意义。
引言
新冠疫情催生疫苗巨大产能需求，推动 Comirnaty 与 Spikevax 两款 mRNA-LNP 疫苗快速落地。两款疫苗安全性、有效性已得到验证，但快速开发与放大生产过程中，因产品与工艺基础数据不足，产生诸多工艺挑战。
过去数年行业研究多聚焦 mRNA 本身稳定性，探究脂质、缓冲液、多价离子、RNase 酶、温度、pH 的影响；但针对 LNP 颗粒自身稳定性的相关研究十分有限。而 LNP 的结构完整性直接决定 mRNA 胞内递送效率，最终影响疫苗药效。
已上市 RNA-LNP 产品（Onpattro、Comirnaty、Spikevax）均由四类脂质构成：
可电离阳离子脂质：酸性环境下结合带负电的 mRNA 骨架实现包裹，同时介导内体逃逸；
辅助脂质 1（磷脂 DSPC）+ 辅助脂质 2（胆固醇）：提升 LNP 结构稳定性、增强细胞递送能力；
PEG 修饰脂质：提供空间位阻抑制颗粒聚集，延长体内循环时间、调控细胞摄取效率。配方中 PEG 脂质可保障长期储存稳定；去除 PEG 后，LNP 多分散指数（PDI）会显著升高。
搅拌、震荡带来的机械应力对 mRNA-LNP 的影响尚未被充分研究：一方面早期缺乏大规模量产经验，另一方面现有制剂常规低温冷冻储存。但无论是生产配制，还是成品取样转运，都不可避免接触搅拌、震荡应力，因此该课题具备极高工艺价值。
已有文献证实：轻弹、手动摇晃、涡旋震荡西林瓶，都会改变 LNP 粒径、PDI 与 mRNA 包封率，行业也强调西林瓶规范操作；另有假说提出
气 - 液界面应力是驱动 LNP 粒径增大、包封率下降的核心诱因，相关实验仅使用摇床、涡旋仪完成。
本文围绕搅拌、震荡对 mRNA-LNP 质量指标的联动影响展开研究，重点建立 LNP 粒径变化与 mRNA 包封率下降的对应关系；先从商业化大罐搅拌实验发现工艺风险，再设计实验室垂直震荡实验，探究顶空体积、LNP 浓度对产品应力敏感性的调控规律，最终提出完整分子作用机制。
结果与讨论
1 搅拌对 mRNA-LNP 理化特性的影响
mRNA-LNP 生产全程多处需要搅拌，目的是保证料液温度、mRNA 浓度均一，稳定产品质量。本实验采用 1600 L 商业化生产反应罐，设置两组对照：低装液量 + 低搅拌转速、高装液量 + 高搅拌转速。
1.1 低装液量搅拌实验
1600 L 罐仅装填 135 L 料液，搅拌桨几乎完全暴露在液面下方，130 RPM 连续搅拌 10 天，全程控温 2~8℃。
mRNA 包封率随搅拌时长线性大幅下降；但毛细管电泳检测显示mRNA 完整性无明显损伤。原因：2~8℃低温 + 无菌罐体、取样管路，大幅降低 mRNA 水解降解。
肉眼可见液面剧烈翻腾、大量气泡卷入料液（卷气现象）。
粒径变化（NanoFlowSizer 检测）：初始为单峰、平均粒径约 60 nm；搅拌 1 天后出现双峰分布；搅拌 4 天后完全转为宽单峰，平均粒径升至 200 nm。
文献首次同步观测到：搅拌导致包封率线性下滑 + 粒径分布双峰化 / 粗化。对照实验证明：仅 2~8℃静置 10 天、无搅拌，产品各项指标无变化。
补充对照：将搅拌转速降至 40 RPM，液面平稳无涡流、泡沫、卷气。连续搅拌 10 天粒径始终维持窄单峰，仅微小波动来自取样与检测误差。直接证明卷气是粒径劣变的核心诱因。
简易肉眼观测可快速判断搅拌损伤：130 RPM 搅拌 10 天样品浑浊不透光；40 RPM 低转速样品澄清透明。原理：小颗粒（60 nm）为瑞利散射，大颗粒（200 nm）为米氏散射；大颗粒对短波长光散射更强，透过样品的光偏黄。
额外验证：40 RPM 澄清样品剧烈摇晃 1 min，浊度进一步上升，透光呈橙红色。肉眼浊度变化可作为快速筛查手段，辅助精密粒度仪判断配制、转运过程是否发生卷气损伤。
1.2 高装液量搅拌实验
罐内装填 741 L 料液，搅拌转速提升至 198 RPM，搅拌 10 天。
mRNA 包封率下降幅度远小于低装液 130 RPM 组；mRNA 完整性依旧不受影响。
尽管搅拌转速更高，但液面距搅拌桨距离大，液面扰动、卷气被显著抑制。证明搅拌剪切力本身影响微弱，卷气才是破坏 LNP 的主导因素。
粒径变化：初始 60 nm 窄单峰，随搅拌缓慢变宽、尾部向大粒径延伸，10 天才微弱出现双峰；劣变速率远慢于低装液组。
稳定性对照：各时间点取样室温放置，仅 mRNA 因高温水解完整性下降，粒径、包封率无额外劣变。
2 震荡对 mRNA-LNP 理化特性的影响
大规模搅拌实验证实：减少卷气可大幅削弱粒径、包封率劣变，说明气 - 液界面应力是核心破坏因素。基于此开展西林瓶垂直震荡实验，系统探究顶空体积（装液量）、LNP 载药浓度（mRNA 浓度） 对产品抗震荡能力的调控规律。
基础实验：2 mL 西林瓶仅灌装 0.48 mL 料液（大顶空），mRNA 浓度 0.12 mg/mL。震荡后粒径演化规律与大罐低装液搅拌完全一致：窄单峰→尾部拖尾（10 min）→双峰（30 min）→大粒径宽单峰（240 min）。
梯度实验设计：同一批原液配 3 种 mRNA 浓度（0.12 / 0.06 / 0.01 mg/mL）；每种浓度分装两类西林瓶：①低灌装 0.48 mL（大顶空）、②高灌装 2.25 mL（小顶空），共 6 组制剂。
规律总结：
高灌装 + 高 mRNA 浓度制剂抗震荡能力最强，粒径增长、包封率衰减幅度最小；低灌装 + 低 mRNA 浓度最脆弱。
高浓度 0.12 mg/mL 组：顶空体积是主要影响变量；低浓度 0.01、0.06 mg/mL 组：mRNA 浓度成为决定性因素，0.01 mg/mL 样品对震荡极敏感。
粒径、PDI 变化趋势：震荡前 2 h 粒径快速上升，2~4 h 增速放缓，4 h 后趋于稳定；PDI 先大幅升高，4 h 后逐步回落。对应粒径分布演化：窄单峰→双峰→大粒径宽单峰。
包封率变化规律与粒径完全负相关：前 2 h 包封率快速下跌，4 h 后趋于平稳；所有组别均存在LNP 粒径越大，mRNA 包封率越低的线性负相关，低包封率区间相关性略微呈二次曲线。
3 损伤机理推导
气泡带来的气 - 液界面应力剥离 LNP 外层 PEG 脂质，完整过程：
气泡撞击 LNP 颗粒表面；
气液界面力剥离颗粒外层 PEG 脂质；
PEG 提供的空间位阻消失，相邻 LNP 发生融合；
融合过程脂质膜短暂破损，部分 mRNA 从颗粒内部释放；
最终形成粒径更大、载药量更低的稳定 LNP。
高灌装（小顶空）：单位液体体积气泡更少，LNP 与气泡接触概率降低，损伤减弱；
高 mRNA 浓度（高 LNP 密度）：同等气泡数量下，单个 LNP 接触气泡概率下降；同时体系总 PEG 脂质更多，不易被界面力耗尽。
该规律与单抗蛋白聚集机理高度相似：低蛋白浓度下气泡诱导聚集更显著；现有蛋白制剂工艺也采用降低气液比、添加表面活性剂缓解界面损伤，侧面佐证本机理合理性。
震荡后期粒径、包封率曲线趋于平缓，源于膜相 PEG 与水相游离 PEG 的动态平衡：持续剥离膜上 PEG 会推动游离 PEG 重新吸附至颗粒表面，平衡位置由 LNP 浓度、顶空气泡量共同决定。低 LNP 浓度体系 PEG 总量少，平衡更易被打破，因此更易劣变。
震荡方法重复性验证：3 组独立重复实验，短时间（30 min）震荡检测误差极小；长时间震荡后粒径偏大，检测离散度上升。工艺筛选建议设置至少 2 个震荡时间点、控制最大震荡时长，才能稳定区分不同制剂的抗应力能力。
结论
商业化搅拌罐实验证实：搅拌桨卷入气泡会同步造成 mRNA 包封率下降、LNP 粒径分布粗化（单峰→双峰→大粒径宽单峰），剪切力本身影响微弱；肉眼浊度可作为快速筛查卷气损伤的简易手段。
实验室西林瓶震荡实验复现大罐结论，明确两大风险变量：大顶空（低灌装量）、低 LNP/mRNA 浓度会大幅提升产品对机械应力的敏感性；LNP 粒径与 mRNA 包封率稳定呈线性负相关。
核心机理：气 - 液界面剥离 LNP 外层 PEG 脂质，颗粒融合、mRNA 泄漏，生成大粒径低载药颗粒。
实验条件为极端应力，不代表正常生产 / 转运场景，但清晰揭示底层劣变通路；虽与蛋白制剂界面聚集规律相通，LNP 融合完整机理仍需后续脂质组分分离实验进一步验证。
工艺指导价值：明确配制搅拌、灌装参数的管控要点，提醒临床转运、西林瓶操作规范；减小容器顶空、提升 LNP 载药浓度是缓解卷气损伤的有效工艺策略。
材料与方法
mRNA-LNP 制剂制备
酸性水相 mRNA 溶液 + 有机相四种脂质经 T 型混合器制备，N:P 固定为 6；全文所有样品脂质配比、流速、浓度统一，mRNA 浓度直接对应 LNP 总浓度。
固定脂质配比（mRNA 0.1 mg/mL 体系）：
ALC-0315（可电离脂质）：1.43 mg/mL
ALC-0159（PEG2000 脂质）：0.18 mg/mL
DSPC 磷脂：0.31 mg/mL
胆固醇：0.62 mg/mL
终缓冲液：10 mM Tris + 300 mM 蔗糖。
搅拌实验设备
1600 L 底部磁力搅拌反应罐，桨叶直径 177 mm，功率 0.75 kW，转速 0~400 RPM；全程 2~8℃控温。
震荡实验设备
立式垂直摇床，每分钟 100 次上下往复，瓶体最大倾斜 20°；室温震荡，震荡完成样品 - 80℃冷冻保存待检测。
检测方法
mRNA 浓度 & 包封率（Ribogreen 荧光法）：未破膜测游离 mRNA；Triton - 乙醇破膜测总 mRNA，计算包封率。
粒径检测
mRNA 完整性（毛细管凝胶电泳）：破膜变性后电泳分离完整 mRNA 与降解片段，荧光定量完整 RNA 占比。
二、全文核心总结
1 研究核心目的
针对 mRNA-LNP 疫苗生产搅拌、成品转运震荡两大场景，揭示机械应力如何破坏产品质量，明确关键风险工艺参数，提出损伤机理与工艺缓解方案。
2 核心实验发现
（1）搅拌损伤的关键诱因是「卷气（气 - 液界面）」，而非搅拌剪切力
低装液、低液面工况：搅拌易卷气，10 天连续搅拌导致包封率大幅下跌、LNP 从 60 nm 单峰变为 200 nm 宽单峰，样品浑浊；
高装液、高液面 / 低转速无卷气工况：即便搅拌转速更高，粒径、包封率劣变程度极轻微；
肉眼浊度可快速定性判断卷气损伤，可作为车间快速筛查手段。
（2）西林瓶震荡损伤两大敏感变量
顶空体积：瓶内空气越多（灌装量越少），气泡与 LNP 接触越多，产品劣变越快；
mRNA/LNP 浓度：浓度越低，同等气泡下单个颗粒承受界面应力越强，包封率、粒径恶化更显著。
最优制剂形式：高灌装量（小顶空）+ 高 mRNA 浓度，抗震荡稳定性最强。
（3）两大质量指标稳定负相关
震荡 / 搅拌应力下，LNP 粒径持续增大，mRNA 包封率同步线性下降，R²=81.96，二者强关联；PDI 先升高后回落，对应颗粒分布从单峰→双峰→大粒径宽单峰。
3 完整损伤分子机理
气泡气液界面剥离 LNP 外层 PEG 脂质→颗粒空间位阻消失、互相融合→融合过程脂质膜破损，内部 mRNA 泄漏→形成粒径更大、载药量更低的新 LNP 颗粒。
高灌装、高浓度可减少气泡 - 颗粒接触，抑制 PEG 剥离，提升稳定性。
4 工艺实操指导（行业价值）
生产配制搅拌：尽量提高反应罐装液量，避免低液位搅拌；控制搅拌转速，减少液面涡流、泡沫、卷气；
灌装西林瓶：在合规范围内尽量提高灌装体积，减小瓶内顶空；优先选用高浓度原液分装；
样品转运 / 临床操作：避免剧烈摇晃、涡旋西林瓶，减少气液界面应力；
质量快速筛查：透光肉眼观察浊度，快速判断是否发生卷气损伤，辅助精密粒度检测；
制剂开发：可通过提升 LNP 浓度、优化灌装规格降低成品运输、使用过程的稳定性风险。
5 研究局限与后续方向
本文采用极端震荡 / 搅拌条件放大损伤效应，不代表常规生产操作；仅推导机理，未直接验证 PEG 脂质从颗粒向水相迁移；后续需开展脂质组分分离定量实验，完整解析 LNP 融合分子通路。
以上部分内容由AI生成，注意甄别。
文献链接：https://aosspic10001.websiteonline.cn/pmo534f31/doc/huirui.pdf
